CRISPR靶向特异性是由两部分决定的，一部分是RNA嵌合体和靶DNA之间的碱基配对，另一部分是Cas9蛋白和一个短DNA序列，这个短的 DNA序列通常在靶DNA的3'末端发现，被称为间隔序列前体临近基序（protospacer adjacent motif，PAM），它存在于病毒DNA中，但不存在于细菌DNA中，有助于防止细菌DNA被自身的免疫系统（CRISPR）切割。

PAM序列在我们的DNA中也很常见，因此CRISPR-Cas9已被用于编辑人类基因组，但是有一定的限制性，不接近PAM的基因不能作为靶点。没有一个相邻、可识别的PAM序列，Cas酶将无法识别或成功附着并切割所需的DNA片段。

包括经典的化脓性链球菌Cas9的变体（SpCas9）在内不同的Cas酶可识别不同的PAM序列，但基因组的大部分仍然无法设靶编辑或更容易产生脱靶突变。例如，SpCas9和SaCas9（来自金黄色葡萄球菌）所识别的PAM序列多含鸟嘌呤/胞嘧啶（G/C-rich），因此利用已报导的碱基编辑系统无法在腺嘌呤/胸腺嘧啶富集（A/T-rich）区域进行精准碱基编辑操作。特别是最常用的SpCas9酶需要GG PAM序列进行识别，以至于其作用限制仅为基因组的9.9％，靶向区域十分局限。

为了克服这个障碍，过去麻省理工大学（MIT）的研究小组曾开发过一种名为SPAMALOT（Search for PAMs by Alignment of Targets）的分析软件（通过目标队列来搜索PAM），对细菌基因组进行生物信息学搜索，以寻找是否存在任何具有限制性较低的PAM的Cas9样酶序列。然后，从生物信息学搜索中创建出最佳匹配的合成版本，并评估它们在CRISPR系统中的效用。但如果一个感兴趣的基因组区域碰巧没有合适的PAM，工程师就得求助另一种Cas酶。

现在，哈佛医学院的生化学家Benjamin P. Kleinstiver博士领导的研究小组设计了不需要特定PAM就能结合和切割DNA的Cas9蛋白变体，命名为SpG和SpRY，能够对绝大多数人类基因组进行不受限打靶，并具有单碱基对精度，从而纠正心脏病、II型糖尿病、骨质疏松症和慢性疼痛等疾病的相关突变。

3月26日，科学家们在《Science》杂志发表了这篇具有重要意义的文章。Kleinstiver博士团队用新方法纠正了过去位于“不可编辑”基因组区域的人类疾病相关突变。

“这些工程蛋白可以更自由地靶向过去不可接近的基因组区域，”Kleinstiver说。“通过几乎完全放宽Cas酶对PAM的识别要求，基因编辑的应用被极大地拓展了。最令人兴奋的意义是，从DNA编辑角度来看，全部基因组都可‘治疗’了！”

“虽然未来需要更精确地阐明SpG和SpRY的氨基酸替换的分子作用，我们推测SpRY通过去除典型的碱基特异性相互作用，置换PAM DNA以促进相互作用来达到其扩大靶向的范围，”作者指出。“在PAM主沟中，通过添加新的非特异性蛋白质：DNA接触进行能量补偿。更实际的是，当考虑用哪种酶进行需要打靶活性的实验时，我们建议用野生型SpCas9用于承载NGG PAMs的站点，用SpG用于 NGH PAMs，用SpRY编辑剩余的NHN PAMs。”