美国俄亥俄州立大学的研究人员近日开发出一种快速的单分子纳米孔测序分析，能够在短短几小时内检测急性髓系白血病（AML）患者的血液样本，了解临床上可行动的标志物和预后标志物。

这个研究团队由俄亥俄州立大学的Esko Kautto和James Blachly领导。他们在Oxford Nanopore Technologies的MinION测序仪上设计了这项检测，旨在当天对AML患者的DNA样本进行分析，以便利用检测到的变异来指导治疗或告知预后。

在本周举行的美国血液学学会（ASH）年会上，Kautto展示了原理验证研究的结果，并将这种方法与短读长测序和毛细管电泳进行比较。尽管该检测还有待进一步的验证和评估才能在临床上使用，但研究人员希望这种更快速更经济的方法能够替代目前的金标准方法。

恶性白血病

目前，急性髓系白血病的五年生存率大约为24%。尽管这是一种遗传异质性的疾病，但多年来人们都笼统采用化疗的手段。最近，多种分子靶向药物已上市，被批准用于某些基因突变的患者。

考虑到这是一种侵袭性的疾病，AML患者最好尽快接受治疗，然而当前的新一代测序检测可能很耗时。Kautto指出，靶向治疗需要靶向诊断，但目前的NGS方法需要一周以上的时间。“对于AML等侵袭性疾病的患者而言，延误治疗或采用化疗手段也许是有害的，”他说。

为了开发出一种更快的检测方法，研究人员决定采用纳米孔测序分析，它的分析流程是在仪器一产生数据时就立即开始分析。“这样，在几个小时内，我们就有了大量的测序数据，并获得了突变检测的最终报告，”Kautto谈道。“相比之下，当我们拿到结果时，传统的NGS检测还处于文库制备的阶段。”

不过，尽管纳米孔测序比传统NGS测序更快，仪器成本也更低，但据说它的原始读取错误率也更高。Kautto估计，纳米孔测序的原始错误率大约在10%。在尝试检测低频率的变异时，这已经算是相当高了。为此，他们花了大量时间来分析错误和优化策略。“这是我们经历过的最大挑战，”他说。

Kautto及其同事建立了质量分数的截断值（cutoff），并过滤掉质量较低的数据，以便降低错误率。他表示：“这之所以可行，是因为将原始信号转换为核苷酸序列的算法具有内在的定量标准，能够显示碱基检出的可信度。”因此，研究人员可以看到质量分数较低的读数，并将其排除在分析之外。此外，他们观察到的大多数是错义突变，而这种突变的错误率往往低于插入缺失（indel）。

纳米孔测序 vs. 传统NGS

之后，研究人员收集了72个野生型和突变样本，利用这种纳米孔分析来检测8个基因中与AML相关的突变，包括DNMT3A、FLT3、IDH1、DH2、JAK2、NPM1、NRAS和KRAS，并将其性能与Illumina MiSeq检测和毛细管电泳进行比较。Kautto重点关注了三种类型的改变：JAK2热点突变、NPM1移码插入以及FLT3基因内部串联重复。

在检测JAK2热点突变时，纳米孔分析和Illumina分析在8个突变样本中表现出高度的相关性，等位基因百分比的范围很广，从4%到94%。这些点突变往往造成激酶JAK持续激活STAT蛋白。

接着，研究人员又评估了纳米孔测序检测NPM1移码插入的能力。大约30%的患者会发生这种突变，并且与疾病缓解后的复发风险相关。Kautto表示，尽管纳米孔测序在插入缺失上往往有着较高的错误率，但这是独特的4-核苷酸移码插入，出现在外显子末端。

“这种突变的特征足够明显，我们可以从背景噪声中将其识别出来，它不会随机出现在我们的数据中，”Kautto说。尽管在这种情况下检测到的变异等位基因百分比低于预期，但可以通过线性模型捕获和调整。

FLT3基因内部串联重复与AML患者预后较差相关，可通过多种靶向药物来治疗。突变导致13号至15号外显子的多个部分重复，但这种插入片段较长，很难通过传统NGS来检测。因此，金标准的方法是毛细管电泳。

他们对48个样本进行突变检测，毛细管电泳显示其中24个样本呈阳性。纳米孔分析检测到所有突变，但传统的NGS只检测到24个中的6个。Kautto指出，纳米孔测序检测到的变异百分比与毛细管电泳相似，而且两者确定的串联重复片段长度几乎相同。

更重要的是，研究人员在摘要中指出，纳米孔测序的结果可在4到6小时内获得，而不像传统的NGS技术那样需要几天。

这种方法也具有成本优势。对于这项研究，Kautto的研究小组使用了MinION流动槽，在样本上添加条形码，因此每次运行可以分析多个样本。他们估计，如果使用Flongle流动槽进行分析，每个样本的成本低于250美元。

未来，Kautto及其同事计划用俄亥俄州立大学的白血病组织库及其他队列的更多样本来进一步验证这项检测。他们还希望改进数据分析和文库制备，优化每个靶点的覆盖范围，并完善其他基因的分析，包括TP53的编码区。