不到十年时间，CRISPR-Cas9已被世界各地用于实验动物和细胞研究，还已经在临床试验中用于治疗患者。虽然大家已经了解并接受了它的脱靶编辑等限制，但研究人员一直在努力通过改善该方法，希望将不良影响最小化。

然而最近，一组研究人员发现除了现有的问题外，CRISPR还在对小鼠进行基因插入时出现大量不必要的重复。令科学家们担心的是，使用标准PCR分析无法检测到插入片段。

这一研究结果于上周（2月12日）发表在Science Advances杂志上。

诺丁汉大学的分子生物学家Ed Bolt（未参与该项研究）表示：“ [本文]是关于基于CRISPR-Cas9的基因编辑在[敲入]编辑方面的另一个警示性故事。”

这项研究始于德国明斯特大学的免疫学研究员Johannes Roth及其同事在研究基因工程小鼠免疫细胞中S100A8基因（编码钙结合蛋白）的功能时，发现该基因未在小鼠中表达。

为了设计这种有条件的基因敲除技术，该团队采用了流行的方法。这需要用构建体替换原始基因，在该构建体中，S100A8的侧翼是指导特定酶切除该基因的特定序列。一旦这些小鼠与仅在靶标组织中表达酶的其他转基因动物杂交，将导致基因在特定组织中的敲除。

研究人员想知道为什么将这次敲入整合效率这么低，所以他们将其中一只与野生型动物杂交，分析得到的后代。这次，他们结合使用了标准PCR，基因测序和定量PCR。这种更全面的方法表明，总体而言，七只小鼠确实具有正确的插入。研究人员更加惊讶的是，其余的动物最多插入三个重复的构建体。这使他们怀疑，这种复制在亲本小鼠及其后代中可能很普遍，而通常用于分析此类构建体的标准PCR形式却忽略了它们。

然后，研究小组检查了从与转基因动物杂交的野生型小鼠中繁殖的小鼠基因组，在转基因动物中有条件地敲除了另一个基因IL4。在这里，他们使用了一种特殊的PCR形式，通过精心设计的引物特别适合扩增重复序列。

值得注意的是，他们发现近50只动物中有30只具有插入的多个拷贝构建片段，而不仅仅是一个。相比之下，当他们使用标准PCR重复进行分析时，他们只在五只动物中发现了，这证实了标准PCR不能捕获重复序列的想法。 “常规PCR方法无法识别它们，” Skryabin解释说。

Southern blot杂交技术非常适合定量分析特定DNA序列的拷贝数，能够确认亲本小鼠及其后代的重复。研究人员在具有不同片段插入的十组小鼠中的九组中发现了重复。在来自野生型和转基因动物杂交的近150个后代中，有57％拥有多个副本。

Skryabin和他的同事Timofey Rozhdestvensky（转基因小鼠专家）指出，如果不使用适用于检测此类重复的技术，研究人员可能无法意识到模型生物基因组中会隐藏不需要的突变。对于产生条件基因敲除小鼠模型的研究人员而言，重复实验可能导致蛋白质在所有组织中被有效敲除或产生其他不良影响，从而损害基因的功能研究。

Skryabin和Rozhdestvensky说，他们的发现可能与从植物到人类细胞的整个生命王国的基因编辑有关。他们表示，重复可能以某种方式导致危险的移码突变，导致蛋白质变形或“在人类基因治疗方法中造成严重的不良影响”。

作者建议研究人员在使用CRISPR进行敲入时，利用特殊形式的PCR分析，Southern印迹法或能够分析重复序列的全基因组测序新方法进行分析，了解是否正确编辑了基因组。

英国Sanger研究所的基因组工程师Katharina Boroviak(未参与这项新研究)对此发现并不感到惊讶。在生成转基因小鼠模型的过程中，她也观察到了插入序列的重复。她补充说，该领域最有经验的研究人员可能已经意识到了这个问题。

她认为，研究人员在进行DNA插入时所使用的技术各不相同，因此需要使用不同的分析方法来确保正确进行编辑。例如，在她的实验室中，“我们通常倾向于进行定量PCR和一整套的PCR，以确保我们能够选出正确的小鼠，而不是仅仅依靠一种PCR模式。”

Boroviak说：“ 这篇论文使得尚未真正考虑过这个的较小型实验室意识到了这一点。” “每个人都在谈论CRISPR的卓越性和出色性，而且如此简单。但是，如果您开始研究细节。 。 。就会发现实际出了什么问题以及实际出错的频率，这比想像的要多。

对于Bolt而言，这些发现强调了更好地了解DNA修复过程的必要性。他说，虽然表面上CRISPR-Cas9是一种简单的基因组编辑工具，但它依赖于DNA修复工作，这一过程“极其复杂”。当Cas9酶切断细胞的基因组时，它会激活基因修复机制。例如，在插入的情况下，激活了同源性指导的修复过程，由此细胞使用DNA模板填充Cas9酶形成的缺口，形成插入。

专门研究基因组不稳定的Bolt说，研究人员对这一过程的工作原理并没有很好的理解，如果研究人员想找到避免该问题并提高CRISPR-Cas9的编辑准确性的方法，那么理解工作原理将是至关重要的，这正是Rozhdestvensky和Skryabin正在努力的事情。

“我们需要明确的是，CRISPR-Cas9是一种用于基因删除和理解生物学的强大方法，”“但是我们距离了解如何使用CRISPR-Cas9插入DNA进行敲入还相距甚远。”